导语
肠道微生物是一个复杂的生物系统，对人体发挥着重要作用。肠道微生物研究技术的发展加快了对微生物组结构和功能的研究。16S测序和宏基因组测序是目前主要的高通量测序依赖的肠道微生物研究方法，16S测序可以对肠道微生物中的所有菌种进行精确定量，而宏基因组测序可以发现的重要编码基因或通路的富集，16S测序和宏基因组测序可以回答“样本当中有哪些微生物，他们具有哪些功能”。今天我们一起了解下年8月发表在CellHostMicrobe（IF=15.）期刊的一篇文章，看看是如何使用16S+宏基因学+代谢组。背景简述
肥胖症和2型糖尿病的共发生是一个很有意思的现象，不禁让人联想到两者的肠道微生物是否有着某种联系。本研究比较了瘦且非糖尿病，肥胖且非糖尿病和肥胖且有2型糖尿病个体的肠道微生物组。发现与2型糖尿病不同的是，肥胖与微生物组变异有关，另外药物和膳食补充剂与微生物种群改变有关。肥胖是T2D的一个危险因素，86%以上的T2D患者有超重或肥胖问题。为了了解从肥胖到T2D的发展过程是否在一定程度上是由肠道微生物群介导的，本文进行了研究，以确定这两种情况下各自独特的微生物群特征。文章要点
（1）肥胖且无2型糖尿病表征与肠道微生物组变异相关；（2）药物和膳食补充剂与肠道微生物组变异相关；（3）高铁摄入影响小鼠的微生物组组分；（4）微生物组的变化会反映在血清代谢产物谱中。实验设计
样本分组：瘦型非糖尿病患者（LH）、肥胖非糖尿病患者(ObH)、T2D肥胖患者(ObD2T)人粪便16SrDNA测序：LH(人)、ObH(人)、ObT2D(人)人粪便宏基因组测序：LH(95人)、ObH(人)、ObT2D(人)人血清代谢组检测：LH(人)、ObH(人)、ObT2D(27人)其他指标记录：生物学指标、饮食和环境数据，比如药物、饮食和膳食补充剂的使用，年龄、性别、BMI和空腹血糖水平等。小鼠16SrDNA测序：正常喂养小鼠（8只）、ppm硫酸亚铁小鼠（8只）、50ppm硫酸亚铁小鼠（8只）。结果分析
01
德国人代谢性疾病队列概况
本研究是来自德国北部人群队列PopGen和FoCus的1,个人（图1）。PopGen和Focus队列记录了有关药物，饮食和膳食补充剂使用的信息，以及广泛的表型特征，包括年龄，性别，BMI，和空腹血糖水平。使用Metabolon平台为名参与者生成非靶向的血清代谢组学谱图，其中包括种已鉴定的代谢物（STAR方法）。将所有个体分为三种表型：（a）瘦（BM=25）且无糖尿病，炎症性肠病（IBD）或肠易激综合症（IBS）且空腹血糖水平低于mg/dl的LH表型；（b）除肥胖（BMI30）外其他与LH相同的ObH表型；（c）肥胖（BMI30）且被诊断为T2D或空腹血糖水平高于mg/dl，且没有IBD和IBS的ObT2D。图1.（A）使用MDS对16SrRNA测序进行属水平分类排序；（B）鸟枪法中的27个核心属与16S数据中相同的分类相匹配。
选择了个样本进行宏基因组测序。在比较这三个人群（LHn=95，ObHn=55和ObT2Dn=51）时，要实现心血管测量的统一性。初步确定了年龄和性别与微生物组组成显着相关,与先前的发现一致。在基于扩增子和基于基因组的分类学概况的初步比较中，受试者内属的丰富度在整个分类单元中都非常一致（图1）。在随后的分析中，研究了六种微生物组特征类型：来自16SrRNA基因测序的分类学丰度[VSEARCH]；来自基因组的物种分类学概况[MetaPhlAn2]；功能图谱[HUMAnN2]概括为MetaCyc和GO通路（STAR方法）以及KEGGOntology（KO）和EnzymeCommission（EC）基因家族（图2）。图2.（A）(B)16S和宏基因组数据的种属分类丰度分布；（C）个宏基因组学的MetaCyc通路富集情况
02
肥胖与特定肠道微生物分类和功能相关，而ObT2D状态与较低的效应量相关
为了确定肥胖且有T2D与个体微生物特征的相关性，使用MaAsLin中的广义线性模型比较了LH，ObH和ObH,ObT2D以评估了每个特征的丰度，并使用boosting作为单变量预筛选进行自动变量选择。对于第一类分析（LH与ObH），从年龄，性别，空腹血糖水平，总铁摄入量以及归类为降压和镇痛药的药物中选择协变量。对于第二项分析（ObH与ObT2D），从年龄，性别和BMI，镇痛药，降压药，二甲双胍和胰岛素药物以及营养素镁和铁的摄入量中选择协变量。分析微生物组特征的alpha多样性，其在肥胖症中显着降低（ObHvsLH），而ObT2D组不然（ObHvsObT2D；图3）。图3.(A)Alpha多样性在肥胖个体中显著减少,而ObH与ObT2D中没有显著差异;
(B)与LH相比，肥胖者的微生物分散性显著增加，在ObH和ObT2D间没有显著差异;
(C)分析与ObT2D相关的的分类群，确定T2D中特定的分类变异。
比较ObH和ObT2D的受试者，调整吃糖尿病药物后微生物分类学特征或功能特征的组成是否有显着差异。在队列中，ObH与微生物组的分类学和功能特征均显着相关；当糖尿病药物正确使用，ObT2D与ObH相比与微生物组特征的相关性较弱。当分析单个微生物属与ObH和ObHT2D的关联时，一共有17个属偏好于肥胖（q0.1）。包括减少的Akkermansia,Faecalibacterium,Oscillibacter和Alistipes。丰富的抗炎症种Faecalibacteriumprausnitzii在肥胖个体中减少，而与T2D没有关联（q0.1）。Faecalibacteriumprausnitzii和Bacteroidesthetaiotaomicron菌群具有与肥胖相关的大多数微生物功能特征（图4）。图4.(A)对与肥胖症相关的独立分类群进行分析确定了17个属，包括prevotella和alistipes;(B)对微生物生长过程的分析确定了22个簇，包括97个与肥胖相关的特征。
03
常用药物和膳食补充剂与肠道微生物组关联的程度与营养变量
药物摄入越来越多地与微生物组组成相关联，通常程度与饮食成分相同或更多，这突出了在微生物组研究中考虑这些暴露的重要性。因此，我们评估了队列中药物，膳食补充剂和膳食摄入与微生物组结构的相关性（STAR方法）。评估了五种主要的药物类别，包括止痛药，抗抑郁药，抗高血压药，消炎药和抗糖尿病药，并且发现这五种药物均与微生物组结构和功能能力有关（使用线性判别分析（LDA）概括为MetaCyc途径）。对饮食的评估显示，在非糖尿病受试者中，肠道微生物组，分类学或功能性饮食与饮食之间的显着相关性（PERMANOVA，q0.05）;微生物组中只有一小部分的差异可以由长期饮食因素来解释，大约是1％–10％（图3），与之前的研究一致。在这种受控的环境下，单个饮食变量变化的可检测效果明显更加明显。在先前关于肠道微生物组和炎症的研究中，膳食铁的摄入已显示出独特的作用。这通常是促炎性的，体内铁的储存量增加是T2D的危险因素。重要的是，这些药物类别和膳食补充剂并非我们的队列所独有。在类似人群中，将近一半的成年人每月至少要接受一种处方药，这会对特别感兴趣的微生物组产生任何影响（图5）。图5.(A)饮食营养，饮食补充剂和药物类别与肠道微生物有着显著关联;(B)小鼠研究相关数据示意图;(C)小鼠粪便微生物组的非线性降维分析表现食物和两种铁饮食的簇分布。
04
血清代谢产物反映肥胖与微生物的关系
肠道微生物组有助于在血清中检测一系列代谢产物，从而为肠道微生物组的变异与循环化合物的分布状态之间提供直接联系。将受试者的血清代谢物谱与受试者的微生物组谱进行整合，发现血清代谢物谱的总体组成与肠道微生物组的显着相关；相同的环境因素本身对血清代谢物也有较小的直接影响，证实了血清代谢物与肠道微生物组以及饮食和药物因素之间存在显着且间接的联系。肥胖和T2D均与总体血清代谢组组成显着相关。在种已鉴定的代谢物中，在受试者中患病率50％的那些被认为是稀有的（n=62），而剩余的丰富（n=）。在检测出的种血清代谢物中，有种个体代谢产物与肥胖相关（图6）。图6.(A)基于MDS对LH、ObH、ObT2D的种代谢物特征进行排序;(B)四种代谢产物与单一分类群丰度的相关性。
通过测试19种药物来源的血清代谢物与肠道微生物组成的关联，发现三种降压衍生物的水平与他们各自使用者以及镇痛代谢产物水杨酸盐的微生物群显着相关。为了评估单个微生物是否在肥胖期间具有相关性，直接对17个分类群和个相对于肥胖有差异的丰富代谢产物进行了相关分析。ObH个体内部的关联模式与LH内部的关联模式不同：LH个体中的关联由Clostridium占主导，但在肥胖者的关联中未发现该类群。在肥胖受试者中有15种代谢物与微生物的关联是重要的，主要与脂质代谢（n=8）和氨基酸（n=5）相关（表S5）。因此，肥胖中这些微生物-代谢物的关联在一起提示了一系列特定的途径，通过这些途径，分类单元及其在肠道中的相关功能可能会影响系统性信号传导，营养摄入和体重增加（图7）。图7.(A)(B)发现的种与肥胖相关的代谢物，以及19种与T2D相关的代谢物。(A)和(B)分别显示MaAsLin发现与肥胖相关的前五种代谢物（LH和ObH）和T2D（ObH与ObT2D）。
文章总结
肥胖和2型糖尿病（T2D）是与微生物组改变有关的代谢性疾病。研究人员分析了来自德国人群的LH者（n=），ObH者（n=）和ObT2D者（n=）的肠道微生物组的分类和功能概况，以及病史，血清代谢组学，生物特征和饮食数据。发现肥胖与微生物组组成，分类群和功能的改变有关，与Akkermansia,Faecalibacterium,Oscillibacter,和Alistipes以及与肠道微生物模式相关的血清代谢物等显着相关。药物（包括降压药和抗糖尿病药）以及膳食补充剂（包括铁）与微生物组变异显着相关。这些结果鉴定到了这些相互关联的代谢性疾病的微生物成分，并确定了饮食和药物对疾病的影响。最后：
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